ПТР-и миқдорӣ дар вақти воқеӣ як усули чен кардани миқдори умумии маҳсулот пас аз ҳар як давраи реаксияи занҷири полимеразӣ (PCR) дар реаксияи амплификацияи ДНК бо истифода аз флюорофор мебошад.Ин усул барои миқдори пайдарпаии мушаххаси ДНК дар намуна истифода мешавад, ки бо усулҳои истинодҳои дохилӣ ё берунӣ санҷида мешавад.Аз замони таъсиси он, таҳлилҳои флюоресцентии миқдорӣ ПЗР дар байни муаллимони лабораторӣ бештар маъмул гаштанд.
Принсипи флуоресцентии PCR: Флуоресцентии PCR, ки бори аввал TaqManPCR ва баъдтар Real-TimePCR номида мешавад, як усули нави миқдори кислотаи нуклеинӣ мебошад, ки аз ҷониби PE (PerkinElmer) дар ИМА дар соли 1995 таҳия шудааст. Техника ба илова кардани зондҳои флуоресцентӣ ё мувофиқ асос ёфтааст. рангҳои флуоресцентӣ ба PCR анъанавӣ барои ноил шудан ба вазифаи миқдорӣ.Принсип: ҳангоми пеш рафтани реаксияи PCR, маҳсулоти реаксияи ПТР ҷамъ мешаванд ва шиддатнокии сигнали флуоресцентӣ ба андозаи баробар меафзояд.Бо ҳар як давра як сигнали шиддатнокии флуорессенсия ҷамъоварӣ карда мешавад, то мо метавонем тағирёбии миқдори маҳсулотро аз рӯи тағирёбии шиддатнокии флуорессенсия назорат кунем ва ба ин васила графики каҷи пурқувватшавии флуоресцентро ба даст орем.
Умуман, хатти пурқувваткунии флуорессенсияро ба се марҳила тақсим кардан мумкин аст: марҳилаи сигнали заминаи флуоресцентӣ, марҳилаи пурқувваткунии экспоненсиалии сигнали флуоресцентӣ ва марҳилаи плато.Дар марҳилаи сигнали пасзамина, сигнали пурқувватшудаи флуоресцентӣ бо сигнали пасзаминаи флуоресцентӣ ниқоб карда мешавад ва тағирот дар миқдори маҳсулотро муайян кардан мумкин нест.Дар марҳилаи плато, маҳсулоти амплификация дигар ба таври экспоненсиалӣ афзоиш намеёбад, байни миқдори маҳсулоти ниҳоӣ ва маблағи қолаби ибтидоӣ робитаи хаттӣ вуҷуд надорад ва рақами нусхаи ибтидоии ДНК-ро дар асоси миқдори ниҳоии маҳсулоти ПТР ҳисоб кардан мумкин нест.Танҳо дар марҳилаи пурқувваткунии экспоненсиалии сигнали флуоресцентӣ робитаи хатӣ байни логарифми маблағи маҳсулоти PCR ва маблағи қолаби ибтидоӣ вуҷуд дорад ва мо метавонем дар ин марҳила миқдори онро интихоб кунем.Барои роҳати миқдор ва муқоиса, ду мафҳуми хеле муҳим ба техникаи флюоресцентии миқдории PCR дар вақти воқеӣ ҷорӣ карда шуданд: ҳадди флуоресцентӣ ва арзиши CT.
Ҳадди сунъӣ дар хатти пурқувваткунии флуоресцент арзиши муқарраршуда мебошад.марҳилаи экспоненсиалии тақвияти PCR.
Арзиши Ct: шумораи давраҳое мебошад, ки сигнали флуоресцентӣ дар ҳар як найчаи реаксия барои расидан ба арзиши домени муқарраршуда гузаштааст.
Муносибати байни арзиши Ct ва қолаби ибтидоӣ: Таҳқиқотҳо нишон доданд, ки арзиши Ct ҳар як қолаб бо логарифми рақами нусхаи ибтидоии ин қолаб робитаи хатӣ дорад, ҳар қадар нусхаҳои рақами нусхаи ибтидоӣ зиёд бошанд, Ct ҳамон қадар хурдтар мешавад. арзиш.Қиматҳои Ct нисбатан устуворанд.Каҷи стандартиро бо истифода аз стандарт бо рақами ибтидоии ибтидоӣ сохтан мумкин аст, ки дар он координати уфуқӣ логарифми рақами нусхаи ибтидоиро ва координати амудӣ арзиши Ct-ро тавре ки дар расми зер нишон дода шудааст, ифода мекунад.
Аз ин рӯ, бо гирифтани арзиши Ct-и намунаи номаълум, рақами нусхаи ибтидоии ин намунаро метавон аз каҷи стандартӣ ҳисоб кард.
Қимати Ct доимӣ нест ва метавонад ба намунаҳои гуногун ва асбобҳои гуногун таъсир расонад, ҳатто агар як намуна дар як асбоб 2 маротиба такрор шавад, арзиши Ct метавонад фарқ кунад.
Санҷишҳои флуорессенси миқдорӣ: Вобаста аз маркерҳои истифодашуда таҳлилҳои флуорессенси миқдорӣ метавонанд ба зондҳои флуоресцентӣ ва рангҳои флуоресцентӣ тақсим карда шаванд.Зондҳои флуоресцентӣ технологияи Beacon (технологияи маякҳои молекулавӣ, ки аз ҷониби Амрико Tagyi намояндагӣ мекунанд), зондҳои TaqMan (аз ҷониби ABI намояндагӣ мекунанд) ва технологияи FRET (намояндагӣ аз ҷониби Roche);рангҳои флуоресцентӣ рангҳои тофтаи флуоресцентӣ ва рангҳои тофтаи флуоресцентиро дар бар мегиранд, намояндаи хоси рангҳои тофтаи флуоресцентӣ SYBRGreen I мебошад, ки ҳоло маъмулан истифода мешавад;тофта Намояндаи хоси рангҳои тофтаи флуоресцентӣ SYBRGreenⅠ мебошад;рангҳои тофтаи флуоресцентӣ EvaGreen, LCGreen ва ғайра мебошанд.
SYBRGreenI як рангест, ки маъмулан истифодашавандаи пайвасткунандаи ДНК барои PCR флуоресцентӣ мебошад, ки ба таври махсус ба ДНК-и дуқабата пайваст мешавад.Дар ҳолати озоди худ, SYBRGreenI флуорессенси заиф мебарорад, аммо вақте ки ба ДНК-и дуқабата пайваст мешавад, флуорессенсияи он 1000 маротиба меафзояд.Аз ин рӯ, сигнали умумии флуоресцентие, ки тавассути реаксия бароварда мешавад, ба миқдори ДНК-и дуқабата мутаносиб аст ва бо афзоиши ҳосили амплификация меафзояд.
Афзалиятҳои рангҳои пайвасткунандаи ДНК-и дуқабата: тарҳи оддии таҷрибавӣ, ҳамагӣ 2 праймер лозим аст, ба тарҳрезии зондҳо лозим нест, ниёз ба тарҳрезии зондҳои сершумор барои санҷиши босуръати генҳои сершумор, қобилияти анҷом додани таҳлили нуқтаи обшавӣ, санҷиши хусусияти реаксияи амплификация, арзиши ибтидоии паст, умумии хуб ва аз ин рӯ бештар дар тадқиқот дар ватан ва хориҷа истифода мешавад.
Усули зондҳои флуоресцентӣ (техникаи Такман): Вақте ки амплификацияи PCR анҷом дода мешавад, як ҷуфт праймерҳо дар якҷоягӣ бо зондҳои мушаххаси флуоресцентӣ илова карда мешаванд.Вақте ки зонд солим аст, сигнали флуоресцентие, ки аз ҷониби гурӯҳи хабарнигор мебарояд, аз ҷониби гурӯҳи хомӯшшуда ҷаббида мешавад ва аз ҷониби асбоби PCR муайян карда намешавад;ҳангоми амплификацияи ПТР (дар марҳилаи васеъшавӣ), фаъолияти 5'-3' ҷудошавии ферментҳои Так зондро ба таври ферментативӣ таназзул карда, гурӯҳи флуорессенси хабарнигор ва гурӯҳи флуорессенси хомӯшшударо месозад.
Барномаҳои флюоресцентии PCR миқдорӣ.
Тадқиқоти биологияи молекулавӣ:
1. Таҳлили миқдории кислотаи нуклеинӣ.Таҳлили миқдорӣ ва сифатии бемориҳои сироятӣ, ошкор кардани микроорганизмҳои патогенӣ ё вирусҳо, аз қабили эпидемияи зукоми A (H1N1), муайян кардани шумораи нусхаҳои генҳои растанӣ ва ҳайвоноти трансгенӣ, муайян кардани суръати ғайрифаъолшавии генҳои RNAi ва ғайра.
2. Таҳлили экспрессияи генҳои дифференсиалӣ.Муқоисаи фарқиятҳои экспрессияи генҳо байни намунаҳои коркардшуда (масалан, табобати доруворӣ, табобати ҷисмонӣ, коркарди кимиёвӣ ва ғ.), фарқиятҳои экспрессияи генҳои мушаххас дар марҳилаҳои гуногун ва тасдиқи микроаррей cDNA ё натиҷаҳои дифференсиалӣ
3. Муайянкунии SNP.Муайян кардани полиморфизмҳои ягонаи нуклеотидҳо барои омӯзиши ҳассосияти инфиродӣ ба бемориҳои гуногун ё вокуниши инфиродӣ ба доруҳои мушаххас муҳим аст ва аз сабаби сохтори оқилонаи маякҳои молекулавӣ, вақте ки иттилооти пайдарпайии SNP маълум аст, осон ва дақиқ аст. ин техникаро барои муайян кардани SNP-и баландсуръат истифода баред.
4. Муайянкунии метилизатсия.Метилизатсия бо бисёр бемориҳои инсон, бахусус саратон алоқаманд аст ва Лэйрд як техникаи бо номи Метилайтро гузориш дод, ки ДНК-ро пеш аз амплификация табобат мекунад, то ситозини метилонидашуда урацил шавад ва ситозини метилонидашуда бетаъсир намонад, бо истифода аз праймерҳои мушаххас ва зондҳои Такман барои фарқ кардани ДНК-и метилонидашуда ва беметилнашуда .ҳассостар.
Тадқиқоти тиббӣ:
1. Ташхиси пеш аз таваллуд: одамон наметавонанд бемориҳои ирсиеро, ки дар натиҷаи тағирёбии маводи ирсӣ ба вуҷуд омадаанд, табобат кунанд ва то ҳол онҳо метавонанд танҳо тавассути назорати пешазинаталӣ теъдоди кӯдакони беморро коҳиш диҳанд, то аз зуҳури бемориҳои гуногуни ирсӣ пешгирӣ кунанд.Ин усули ғайриинвазивӣ аст, ки аз ҷониби занони ҳомиладор ба осонӣ қабул карда мешавад.
2. Муайян кардани патоген: Таҳлили флюоресцентии PCR имкон медиҳад, ки миқдорӣ муайян кардани микроорганизмҳо ба монанди gonococcus, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma solium, вируси папилломаи инсон, вируси герпеси оддӣ, вируси норасоии масунияти одам, вируси гепатит, вируси зуком, tuberculosis, MycobactcyV.Он дар муқоиса бо усулҳои анъанавии санҷиш бартариҳои ҳассосияти баланд, андозаи ками намуна, суръат ва соддаро дорад.
3. Арзёбии самаранокии маводи мухаддир: таҳлили миқдории вируси гепатити В (HBV) ва вируси гепатити С (HCV) нишон медиҳад, ки робитаи байни сарбории вирусӣ ва самаранокии баъзе доруҳо.Агар ҳангоми муолиҷаи ламивудин сатҳи зардоби HBV-DNA паст шавад ва баъдан дубора зиёд шавад ё аз сатҳи қаблӣ зиёд шавад, ин нишон медиҳад, ки мутацияи вирус.
4. Санҷиши онкогенетикӣ: Ҳарчанд механизми инкишофи варамҳо то ҳол равшан нест, ба таври васеъ эътироф шудааст, ки мутатсияҳо дар генҳои мувофиқ сабаби аслии табдилёбии онкогенӣ мебошанд.Афзоиши экспрессия ва мутатсияи онкогенҳоро дар марҳилаҳои аввали бисёр варамҳо дидан мумкин аст.PCR-и миқдорӣ дар вақти воқеӣ на танҳо дар ошкор кардани мутатсия дар генҳо самаранок аст, балки метавонад ифодаи онкогенҳоро дақиқ муайян кунад.Ин усул барои муайян кардани ифодаи генҳои гуногун, аз ҷумла гени теломерази hTERT, гени лейкемияи музмини гранулоцитикии WT1, гени онкогении ER, гени саратони простата PSM ва генҳои вирусии бо варам алоқаманд истифода шудааст.
Тарҷума бо www.DeepL.com/Translator (версияи ройгон)
Вақти фиристодан: июн-21-2022